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Biorremediación estimulada por efluentes cloacales tratados de suelos contaminados con hidrocarburos.

 

Autor: Leandro Pellini.

Directora de Tesis: Lic. María Eugenia Parolo.

Co - Directora de Tesis: Bioq. Irene E. Zajonskovsky.

Tutor: Ing. Juan D. Vasallo


Escuela Superior de Salud y Ambiente

Universidad Nacional del Comahue

 

Lugar de Trabajo: Laboratorios de la Escuela Superior de Salud y Ambiente – Departamento de Química de la Facultad de Ingeniería. Universidad Nacional del Comahue. 2006

Materiales y Métodos

1.10. Características del área

1.10.1.    Características climáticas

1.10.2.    Condiciones climáticas del área.

1.10.3.    Características del Sitio Seleccionado

1.10.4.    Ubicación

1.11. Obtención del Suelo y Pretratamiento

1.12. Enmienda del Suelo Correspondiente al Tratamiento EST

1.13. Fortificación del Suelo con Hidrocarburos

1.14. Diseño Experimental

1.15. Determinación de Microorganismos Mesófilos Heterótrofos Totales

1.15.1.    Toma de Muestras y Diluciones para Recuento Microbiológico

1.15.2.    Incubación y Lectura

1.15.3.    Recuento de Microorganismos Viables

 

 

1.10.      Características del área

El área se encuentra próxima a la barda que se ubica paralela al Río Neuquén, presenta una superficie bastante quebrada, con pendientes cortas pero pronunciadas, es una de las pocas áreas relativamente llanas que se pueden encontrar en el territorio. Presenta algunos cauces temporarios con gran concentración de sales. Las precipitaciones características de la zona son de corta duración pero torrenciales, en una sola lluvia puede completarse la media de precipitaciones esperada para ese mes del año, la caída del agua de lluvia modifica el relieve con regularidad arrastrando el material erosionable de las bardas.

1.10.1.Características climáticas

El aire que ingresa a la zona desde el Océano Pacífico descarga toda su humedad al pasar por la Cordillera de los Andes. No llegan vientos desde el Océano Atlántico. Durante el verano la región presenta una temperatura media es de 25 ºC, mientras que en invierno la media puede variar entre 4 y 6 ºC. También pueden presentarse algunas heladas.

Las precipitaciones son escasas, no superan los 200 mm. anuales, las altas temperaturas y los vientos carentes de humedad evaporan el agua y contribuyen a la aridez de la región (Pérez, D. R: Navarro, M. C. 2005).

A pesar de su situación dentro de un oasis es una región bastante desértica, tiene un clima estival netamente desértico, es decir caluroso y seco, atenuado por la gran amplitud térmica que hace descender la temperatura por las noches. La diferencia entre la temperatura del mes más caliente y la del más frío se eleva a 17.5 ºC. Los vientos promedio son de 18 km/h en diciembre y de 9 km/h en julio. La temperatura media del mes de enero - el mes más cálido- se ubica en los 23.2 ºC y en el mes más frío, julio, es de 5,7 ºC. La Tabla Nº 2 presenta los datos característicos el al región en estudio.

1.10.2.Condiciones climáticas del área.

Condición climática

Medición

Temperatura media anual

14 ºC

Amplitud media anual

16ºC

Temperatura máxima anual

20-23ºC

Período libre de heladas (días)

150-180

Lluvias (mm)

130

Déficit hídrico anual

500>¤=600

Exceso anual de agua

0

Clima

Árido

Régimen de humedad del suelo

Arídico

Régimen de temperatura del suelo

Térmico mésico

Vegetación

Estepa arbustiva

1.10.3.Características del Sitio Seleccionado

Para la realización de esta experiencia se trabajó con suelos provenientes de la provincia de Neuquén, representativos de la región. Se seleccionó este sitio porque se encuentra dentro de los límites de la ciudad y en este lugar no se registraron derrames de petróleo o sus derivados, tampoco se ha desarrollado la actividad hidrocarburífera.

A partir de estas observaciones es que se incrementan las posibilidades de obtener un suelo sin afectaciones, lo cual facilita la labor de contaminación del suelo con la concentración contaminante predeterminada.

1.10.4.Ubicación

En la imagen satelital, se observa que el sitio donde se obtuvo el suelo se encuentra en la zona Norte de la Ciudad de Neuquén.

Cuadro de texto: Río Limay

El lugar donde  se extrajo el suelo para realizar la experiencia se ubica en el sector norte de la Ciudad de Neuquén.

Sitio de obtención del suelo tomando como referencia la Universidad Nacional del Comahue. En imagen anexa la ampliación del sitio, al Noroeste del acceso al Barrio Rincón de Emilio.

El suelo para realizar la experiencia, proviene de un sitio ubicado sobre las coordenadas del sistema Gauss Kruguer campo inchauspe X: 2581750, Y: 4691616 y Z: 270.

Sitio de donde se extrajo el suelo.

No se registraron precipitaciones en los siete días precedentes a la extracción del material por lo que el suelo se presentó relativamente seco.

1.11.      Obtención del Suelo y Pretratamiento

El suelo se extrajo de los 15 centímetros superficiales, utilizando una pala barreno para excavar y bolsas de polietileno de alto micronaje como recipiente para el transporte. El suelo en ese momento presentaba un aspecto suelto, con pocos agregados y de apariencia arenopedregosa. Se tomaron alrededor de 80 Kg de suelo, este lote fue homogenizado en el lugar por medio de volteos sucesivos sobre una membrana de polímero plástico. Una vez transportado al laboratorio, el suelo se dejó secar al ambiente durante 48 horas. Posteriormente se homogeneizó utilizando  un mortero de porcelana y se pasó a través de una malla metálica de 2mm (12 mesh).

Este material que luego del proceso se tornó en apariencia arenoso, como se muestra en la Figura Nº 5, se depositó en cuatro bateas plásticas.

 Recipiente conteniendo el suelo pretratado en el laboratorio.

Una porción de aproximadamente 300 g de suelo se envió al Laboratorio de Servicios Agrarios y Forestales (LASAF) perteneciente al Ente Provincial de Agua y Saneamiento para su análisis fisicoquímico.

Se determinó la textura de las muestras a través  del método de Bouyocus.

Para la medición del pH se utilizó la técnica de medición potenciométrica de pH en pasta y pH hidrólisis 1:2,5.

Para la determinación de la materia orgánica se utilizó el método Walkley Black

En la determinación de la conductividad eléctrica se utiliza un conductímetro sobre el extracto de saturación, aunque también pueden utilizarse distintas diluciones de suelo en agua.

El contenido de Fósforo se determinó por medio del método Olsen sobre la cantidad de fósforo extraída por una solución de bicarbonato de sodio (extractante Olsen).

1.12.      Enmienda del Suelo Correspondiente al Tratamiento EST

La incorporación de nutrientes al suelo se llevó a cabo respetando la  relación C/N/P 100:10:0,1 (Adams Shroeder, R.H. et al. 1999). Para lo cual se agregó Triple 15 (15% de N, 15% de P2 O5 y 15% de K2O) y NH4NO3.

Se incorporó las siguientes cantidades a 1500 g de suelo:

Triple 15           450 mg.

NH4NO3          720 mg.

1.13.      Fortificación del Suelo con Hidrocarburos

Se utilizó una solución de fortificación de aceite mineral monogrado para motores de vehículos, marca YPF, tipo SAE 30 normal, esta solución se denominó “solución de fortificación”. El solvente utilizado fue freón.

Para todas las experiencias se preparó una única mezcla suelo- contaminante (el contaminante fue aceite de motor virgen) que se distribuyó en los distintos recipientes.

La solución de fortificación, se preparó, en una relación de 500 mL de freón y 20 g de aceite contaminante por cada 1000 g de suelo, con el objeto de obtener una contaminación inicial del 2%. Luego de agregada la solución de fortificación se homogeneizó el suelo por completo, mezclando a intervalos de 2 h. El suelo contaminado presentaba la textura arenosa original, aunque con una coloración más oscura, consistencia pastosa y sin olor apreciable. El freón se dejó volatilizar durante 24 horas bajo campana, homogeneizando el suelo a intervalos regulares. Una vez finalizada ésta operación, el suelo fue dispuesto en los recipientes plásticos correspondientes donde se someterán a los distintos tratamientos.

Imagen del suelo luego de la contaminación.

1.14.       Diseño Experimental

Se realizaron dos tratamientos de biorremediación, el primer tratamiento es un proceso de biorremediación tradicional llamado en este trabajo “EST”, y el otro es un tratamiento de biorremediación donde los nutrientes inorgánicos y la humedad son aportados por el efluente tratado de la Planta Depuradora de Líquidos Cloacales del Parque Industrial de la Ciudad de Neuquén, y fue denominado “EFL”.

Los tratamientos se llevaron a cabo en recipientes plásticos, en cada uno de los cuales se colocó 1500 g de suelo para facilitar la homogeneización del mismo (Figura Nº 6 y Nº 7).

El diseño experimental fue el siguiente:

Cuatro recipientes correspondientes al tratamiento EST.

Cuatro recipientes correspondientes al tratamiento EFL.

Dos recipientes para los suelos control del tratamiento EST.

Dos recipientes para los suelos control del tratamiento EFL.

Estos recipientes fueron almacenados en estantes, a una temperatura de 20 ºC con una variación de ± 1 ºC. Dos veces por semana se aireó y mezcló todo el contenido de cada maceta con una espátula, y la reposición del agua evaporada se realizó por adición de 50 mL de agua dos a tres veces por semana, esto último con el objeto de mantener la humedad del suelo cercana al 10% (Ercoli, E. et al., 2000).

Espacio físico donde se almacenaron las macetas.

El muestreo para el análisis de hidrocarburos totales de petróleo y recuento de microorganismos heterótrofos totales se realizó a los 0, 15, 30, 60 y 90 días.

Se realizaron recuentos estándar en placa de los líquidos cloacales utilizados.

Reactivos y Materiales para la Determinación de Hidrocarburos Totales en Suelos

Para la realización del presente trabajo, se utilizaron los siguientes reactivos de laboratorio:

Tetracloruro de carbono pro análisis (Merck).

Tetracloruro de carbono grado espectroscópico (Merck).

Acetona pura (Dorwil).

Silica Gel, 100-200mesh (Merck).

Sulfato de Sodio anhidro (Baker).

Mezcla de Referencia, en relación 15:15:10 de n-hexadecano: isooctano: clorobenceno; respectivamente (Buck Scientific, Inc.).

El Instrumental utilizado fue el siguiente:

Balanza analítica (Figura Nº 10).

Balanza granataria (Figura Nº 10).

Espectrofotómetro IR Buck Scientific M500, de Haz Simple (Figura Nº 8).

Espectrofotómetro IR.

Misceláneos

Mortero de porcelana.

Tamiz, 2mm.

Material de vidrio de uso corriente en el laboratorio.

Equipo para extracción por Soxhlet.

Manta calefactora para balones de 25 mL.

Agitador magnético.

Papel de filtro, banda negra, Whatman Nº 40, de 9 cm de diâmetro.

Estufa de secado (Figura Nº 9).

Pipeta automática.

Dispenser para medios de cultivo.

Vórtex.

Autoclave.

Estufa para esterilización.

Estufa para cultivo de bacterias.

Estufa de secado.

Balaza analítica y balanza granataria.

Toma de Muestras de Suelo para Análisis Químicos

Se tomó una muestra por cada maceta de la siguiente forma: primero se realizó la homogeneización de todo el contenido de la maceta empleando una espátula, luego se dividió la superficie del suelo dentro de las macetas, formando una cuadrícula de nueve cuadrantes, de estos cuales se tomó una porción de suelo de tres de ellos elegidos al azar, las porciones de suelo se mezclan para conformar una única muestra.

Metodología de muestreo para análisis de HTP´s.

El procedimiento se repite para cada muestra a analizar.

Preparación de las Muestras para el Análisis de Hidrocarburos Totales en Suelo

A cada una de las muestras así obtenidas se las depositó en un erlenmeyer numerado, el cual fue tarado, posteriormente se agrega Na2SO4 anhidro con el objeto de capturar la humedad remanente en la muestra, la boca del erlenmeyer se cierra con un film de polietileno para evitar el intercambio de humedad entre la muestra y el ambiente.

De esta forma, la muestra queda preparada y debe almacenarse durante 24 hs, tiempo suficiente para que el Na2SO4 retenga toda la humedad de la muestra.

Extracción de Hidrocarburos del Suelo

El erlenmeyer conteniendo el suelo se pesa en balanza analítica para precisar su contenido por diferencia entre el peso del erlenmeyer vacío y el peso del erlenmeyer con el suelo. En el momento de la extracción, el suelo contenido en el erlenmeyer se trasvasa a un cartucho de papel para utilizar en el equipo de extracción soxhlet. Aproximadamente 7 g. se tulizarón para la extracción

La extracción se llevó a cabo con CCL4 y realizó utilizando un equipo soxhlet por cada muestra, y mantas calefactoras con balones de 25 mL.

Dentro del equipo de extracción, el solvente recircula constantemente, evaporándose desde el balón inferior y condensándose en el refrigerante superior para gotear sobre la muestra en el cuerpo central del equipo de extracción. Una vez que el solvente en el cuerpo central alcanza determinado nivel, la muestra se encuentra completamente en contacto con el solvente y un mecanismo sifón, drena el solvente desde el cuerpo central al balón en la parte inferior del equipo recomenzando el ciclo.

Al completarse el tiempo de extracción (4 hs.), se enfría y filtra la solución, y se lleva a volumen en matraz de 25 mL.

Equipos de extracción por soxhlet.

Eliminación de Interferencias

Debido a que el método de cuantificación del analito es sensible a sustancias que derivan de animales o vegetales así como a otros compuestos polares, es necesario eliminar tales interferentes, con el objeto de preservar en el extracto los hidrocarburos petrogénicos.

Para lograr esto, se tratan 10 mL. del extracto obtenido con 3 g. de sílicagel 100-200 mesh utilizando un erlenmeyer, se homogeneizó por medio de un agitador magnético durante 15 minutos, y posteriormente al extracto se lo filtró, empleando para ello papel de filtro de tipo Whataman banda negra de 9 cm. de diámetro y embudos de vidrio. Los extractos obtenidos del filtrado, se cierran herméticamente y se almacenan refrigerados

Construcción de la Curva de Calibración

Para cuantificar HTP´s del suelo  se prepararon soluciones estándar de hidrocarburos de concentración conocida, utilizadas para construir luego la curva de calibración.

Las soluciones estándar fueron preparadas a partir de una solución Stock obtenida de una mezcla de Referencia (Referece Oil), La misma está compuesta por una mezcla de 15:15:10 de n-hexadecano; isooctano y clorobenceno respectivamente. La solución de referencia tiene un valor certificado de 99,95% de HTP.

Posteriormente se registraron los valores de Absorbancia a 2939,7 cm-1 utilizando una celda de cuarzo de 1cm.

En base a las soluciones concentraciones de las patrón preparadas y las absorbancias obtenidas de las mismas, se logra confeccionar la Tabla Nº 3.

Valores de absorbancia de soluciones standard de hidrocarburos.

Estándar

Concentración (mg HC/ 100mL)

Absorbancia

1

3,42

0,1286

2

6,84

0,2047

3

10,26

0,3229

4

13,68

0,4121

5

17,1

0,4673

La correspondiente curva de calibración se muestra en la Figura Nº 13. En esta curva de calibración se exhibe en el eje de las ordenadas el valor de absorbancia obtenido, y en el eje de las abscisas el valor de concentración de las soluciones estándar.

Curva de calibración para HTP´s.

Limite de Detección

El límite de detección de la técnica se define como “la concentración de analito que da una señal significativamente diferente a la señal de fondo ó blanco (Yb)”. Se especifica también como la concentración de analito que produce una señal tres veces mayor que la desviación estándar de la señal de fondo ó blanco, según la siguiente ecuación:

Y - Yb = 3 Sb

Donde:

Y: Límite de detección

Yb: Señal del blanco (se estima utilizando el valor de la ordenada al origen de la recta expresada en (3.1))

Y

Sb= S x/y = [ Σ(yi - yi*)2 / n-2] ½

Donde:

yi : valor de absorbancia registrado para cada solución estándar

yi *: valor ajustado de yi, sobre la recta de tendencia calculada

El límite de detección para esta técnica fue determinado previamente (Brissio, 2005):

x : 22,12 mg Hidrocarburo/ kg suelo seco

Recuperación del Método

La recuperación del método se realiza para conocer la eficiencia del método de extracción, este procedimiento influye en gran medida en la confiabilidad de los resultados.

Consiste en contaminar un suelo blanco con un aceite (que en este caso se trata del mismo aceite utilizado a lo largo de todo el trabajo) a una concentración conocida, y luego extraer el contaminante por el método de extracción seleccionado.

La confiabilidad de los resultados obtenidos mediante la técnica de extracción por solvente, recomendada por el Método 3540C de la US EPA, puede verse afectada por la pérdida de analitos volátiles, lo cual constituye una limitación reconocida de dicha técnica. No obstante, se utilizó este procedimiento de extracción en el presente trabajo, debido a que es altamente improbable encontrar compuestos orgánicos volátiles en el suelo analizado y a que el hidrocarburo para cuantificar es pesado. Aún así debe tenerse en cuenta que el método puede no alcanzar el 100 % en la extracción debido a diversas variables, por ello se calcula el porcentaje de recuperación del método.

La recuperación de la extracción en Soxhlet, con CCl4 como solvente,  de muestras de suelo contaminado de similares características a las analizadas, ha sido examinada en trabajos anteriores, obteniéndose una recuperación del 85.8 % (Brissio, 2005).

Determinación de Peso Seco del Suelo

Una fracción de 10 g de suelo se colocó en un crisol y se llevó a estufa a una temperatura de 110 ºC hasta que el peso de la muestra se mantuvo constante. Las determinaciones se llevaron a cabo por triplicado. El porcentaje de humedad del suelo se calculó de la siguiente manera:

% H = (pssa-psse)/pssax100.

Donde: pssa: peso del suelo seco al aire.

             psse: peso del suelo seco a estufa.

1.15.      Determinación de Microorganismos Mesófilos Heterótrofos Totales

Se utilizó la técnica del Número más Probable (NMP) en medio líquido (Boonchan et al., 2000; Peressutti et al., 2003, Van Hamme et al., 2003), empleando un medio de cultivo completo (PTGY), cuya composición se presenta en la Tabla Nº 4.

Composición del medio de cultivo.

Componente

Peso

Peptona

0.25 g.

Triptona

0.25 g.

Extracto de Levadura

0.50 g.

Glucosa

0.50 g.

MgSO4.7H2O

0.30 g.

CaCl2.2H2O

0.0035 g.

Agua Destilada

1000 mL.

Fraccionamiento del Medio de Cultivo y del Líquido de Dilución

Luego de preparado, se fracciona el medio de cultivo en tubos de ensayo a razón de 5 mL por tubo, y se esteriliza en autoclave a 121 ºC y 1 atm de presión durante 15 minutos. El número de tubos conteniendo medio de cultivo, será determinado por la cantidad de tubos a sembrar según las diluciones calculadas para cada muestreo, siendo necesarios tres tubos por dilución.

Por otro lado se dispone una determinada cantidad de tubos de ensayo con 9 mL de agua destilada cada uno, para la realización de las correspondientes diluciones que la técnica a efectuar indica. Estos tubos se esterilizan previamente en autoclave.

1.15.1.Toma de Muestras y Diluciones para Recuento Microbiológico

Se toma una muestra de cada uno de los cuatro microcosmos, correspondientes a un mismo tratamiento, se recoge 1 g. en condiciones estériles, se conforma una muestra única (“pool”) por tratamiento y se homogeneiza.

De la misma forma se toman 5 g. en placa de petri para determinar el porcentaje de humedad del suelo. Las placas de petri conteniendo 5 g. de suelo se colocan en estufa a 110 ºC, hasta peso constante.

El contenido de humedad del suelo se determina por la diferencia de peso, antes y después de secarlo en estufa. El procedimiento se esquematiza en la Figura Nº 14.

Toma de muestras para recuento microbiológico.

De dicha muestra única se pesa 1 gramo y se introduce en un tubo de ensayo, conteniendo 9 mL del líquido de dilución (agua destilada estéril), el cual corresponde a un primer nivel de dilución de 1:10 (10-1). Se agita en el vórtex. Se toma 1 mL del sobrenadante de ésta primera dilución, con una pipeta estéril, y se lo coloca en un segundo tubo conteniendo 9 mL de agua destilada estéril, el cual corresponde a la segunda dilución (10-2). Así, se procede de la misma manera hasta alcanzar el último nivel de dilución establecido (10-10) (Figura Nº 15).

Dilución de las muestras de suelo, para siembra de microorganismos.

Siembra de las Muestras

 Mesada para siembra de bacterias heterótrofas totales.

Una vez que se dispone de todas las diluciones, se siembra una alícuota de 0,1 mL, por triplicado, de cada dilución en los tubos con medio de cultivo previamente preparados (Figura Nº 17).

Siembra de medios de cultivo a partir de las diluciones.

Este procedimiento se realiza para cada tratamiento.

1.15.2.Incubación y Lectura

Los tubos son incubados durante 7 días a temperatura ambiente.  Al octavo día se realiza la lectura de los mismos, tomándose como positivos a aquellos tubos que presentan turbidez debido al desarrollo microbiano.

Luego se determina estadísticamente el número de bacterias por gramo de suelo seco (Nº bact.gr suelo-1), mediante la tabla de Mc Crady, para tres réplicas por dilución (Ver en anexo).

1.15.3.Recuento de Microorganismos Viables

Con el objeto de estimar cual es la carga incorporada de bacterias vivas en el tratamiento EFL a través del líquido cloacal tratado, se realizó un recuento de bacterias viables.

Célula viable, se define como la que es capaz de dividirse y formar una progenie.

El método preferido para este trabajo es el Recuento Estándar en Placa por la técnica de agar volcado “Pour Plate”, en esta técnica se realizan diluciones de la muestra en forma similar a la técnica del “Número más Probable”

De cada dilución se toman tres alícuotas de 1 mL. y se depositan cada una en una placa de petri estéril, a continuación se agrega a cada placa una cantidad de 11 o 12 mL. de agar fundido, el cual a sido enfriado a 45 ºC (Figura Nº 18) luego las placas se colocan en una mesa lisa y nivelada hasta que solidifica el agar, posteriormente se deben invertir las placas en incubar manteniéndolas a temperatura ambiente por 48 hs.

Es fundamental trabajar siempre en el área de influencia del cono estéril del mechero, tanto para la siembra como para el volcado del agar.

Esta técnica puede ser usada para determinar unidades formadoras de colonias por mililitro o por gramo de muestra.

Ejemplo de siembra de bacterias en placa de petri.

La práctica común, la que tiene el mayor significado estadístico, es la de contar solamente aquellas placas que tengan entre 30 y 300 colonias.

Para obtener el número apropiado de colonias, usualmente se debe diluir la muestra a contar. Como rara vez se conoce la cuenta viable aproximada en un momento dado, suele ser necesario hacer más de una dilución.

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